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作者：吴长有编

出版社：人民卫生出版社

出版时间：2014-06-01

书籍编号：30611651

ISBN：9787117188685

正文语种：中文

字数：329666

版次：

所属分类：科学新知-医学

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图书在版编目（CIP）数据

流式细胞术的基础和临床应用/吴长有主编.—北京：人民卫生出版社，2014

ISBN 978-7-117-18868-5

Ⅰ.①流…　Ⅱ.①吴…　Ⅲ.①细胞-生物样品分析-定量分析　Ⅳ.①Q2-33

中国版本图书馆CIP数据核字（2014）第068822号

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流式细胞术的基础和临床应用

主　　编：吴长有

出版发行：人民卫生出版社有限公司

　　　　　人民卫生电子音像出版社有限公司

地　　址：北京市朝阳区潘家园南里19号

邮　　编：100021

E - mail：ipmph@pmph.com

制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司

排　　版：人民卫生电子音像出版社有限公司

制作时间：2015年9月

版 本 号：V1.0

格　　式：mobi

标准书号：ISBN 978-7-117-18868-5

策划编辑：兰　南

责任编辑：陈小蕾

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前言

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选。流式细胞术综合运用电子、激光、计算机以及流体力学等方法，可在极短的时间内高速分析上万个细胞，同时从一个细胞中测得多个参数。与传统的荧光显微镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。更值得注意的是，流式细胞术可以从单细胞水平检测细胞的免疫表型特征及生物学功能的变化。近几年来，国内外对流式细胞术的发展做了不少的研究工作，目前人们逐步对流式细胞术所需要的样品的制备、标记方法及应用范围等进行了深入的研究。

早在20世纪30年代，Moldaven最早提出了使细胞检测自动化并试图使用光电仪记录流过毛细管的细胞。随后，科学家们研究并描述了一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。在1973年，斯坦福大学成功发明了世界上第一台流式细胞仪，从此流式细胞仪的研发及应用进入了飞速发展的时代。激光技术、喷射技术及计算机的应用使流式细胞仪在原理和结构上形成了固定的模式。20世纪80年代后，流式细胞仪逐渐商品化并提高了其硬件的更新速度。现在流式细胞术在免疫学、肿瘤学、血液学等领域中的广泛应用具有重要的意义。

在本书中我们分别阐述了流式细胞术的原理、技术以及方法等基础知识，进一步分析了流式细胞术及其分选技术在机体免疫功能、细胞周期、细胞凋亡等基础研究以及临床疾病中的应用和最新研究进展。在第一章中，我们介绍了流式细胞术的基本概念、基本结构、工作原理、常用的染色技术、流式结果分析方法以及流式检测的基本方法与技巧等，为深入了解流式细胞术的广泛应用提供了一定的理论基础。第二章重点阐述流式细胞术在基础研究如细胞群比例测定、细胞表型鉴定、细胞因子检测、细胞增殖及凋亡、细胞杀伤能力等方面的应用。鉴于流式细胞术在科学研究中的广泛应用，科学家们早在20世纪60年代末就提出了细胞分选的方法；在20世纪70年代初，Herzenberg研制出了细胞分选器的改进型，可以检测经过荧光标记抗体染色的细胞较弱的荧光信号。自流式分选技术发展至今，其技术也越来越成熟。在本章节中，我们重点介绍了流式分选术的概念及其应用，比较了流式分选与磁性分选的区别，阐述了流式分选术对于独立或非独立群体、低比例群体的细胞以及造血干细胞、间充质干细胞、肿瘤干细胞等的分选方法，为深入了解流式细胞分选技术提供了一定的参考。随着流式细胞术在研究领域的广泛应用，流式细胞分析也逐渐在临床疾病的诊断、检测与治疗中展现了重要的应用价值。第三章讲述了流式细胞术在临床疾病如感染性疾病、血液系统疾病、阵发性睡眠性血红蛋白尿及强直性脊柱炎等自身免疫性疾病、肿瘤等多种疾病的检测与治疗中的广泛应用。对流式细胞术的应用价值的探讨有助于读者开阔视野，深入了解流式细胞术在临床疾病治疗中的应用价值，更好地建立起临床与科研之间的桥梁。

本书邀请了在相应研究领域具有丰富经验的专家教授及中青年科研工作者参与各个章节的编写，汇集了他们多年的工作经验和科研成果。各章节的内容对于科研工作和临床检测、治疗等有着重要的参考与应用价值；另外，本书中涉及的流式细胞术的检测技术与方法等可以为科研工作者提供一定的参考依据；书中各章节均配有相对应的图表说明，有利于读者更容易地理解和掌握流式细胞术的基本知识与技术方法。本书将流式细胞术的基础理论与临床应用相结合，体现了流式细胞术发展的历程及其最新的发展趋势。

本书在编写过程中，各章节的编写风格和重点不尽相同，在内容上也可能存在一定的交叉，望读者在阅读时从不同的角度了解流式细胞术的基本概念、检测方法、临床应用等方面。另外，书中可能存在一定的问题与不足，甚至错误之处，敬请读者、专家和同行们批评指正。

吴长有

中山大学中山医学院免疫学研究所

2014年4月

第一章　总　论

第一节　流式细胞术与流式细胞仪概述

一、流式细胞术概述

1.什么是流式细胞仪

流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是现代激光技术、电子技术、单克隆抗体技术的智慧结晶，是生命科学研究及临床检验领域先进的科学仪器之一。流式细胞仪使细胞或其他颗粒成单个串状排列流经检测区，通过接收激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号所反映细胞的物理化学特征，如细胞的大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等的一种仪器。单细胞分析的优势在于可以快速分析细胞（10 000～200 000细胞/秒），能记录大量细胞的统计信息并关联汇总。它具有分析速度快、检测参数多、结果客观全面等特点，近年来已经广泛用于免疫学、细胞生物学、基因组学等基础科学研究以及血液病、感染和肿瘤等临床疾病的分析检测中。

2.激发光源

市场上的绝大多数流式细胞仪选择激光作为激发细胞上荧光标记的光源，因为激光的优势在于：①激发光强度大，可以产生足够强的信号；②单色性好，背景低，稳定性高，容易聚焦成形，理想的情况下，液流中的细胞可以快速通过检测区均激发单一细胞。根据激光工作物质的不同可以将其划分为气体激光器、固体激光器以及半导体激光器等；也可以根据其激发波长不同将激光器分类，目前使用范围较广的激光为405nm激光、488nm激光和638nm激光。

3.流式细胞仪检测的对象：细胞（颗粒或事件）

Cytometer由两个希腊单词组成：“细胞”和“检测”。但今天的流式细胞仪，所检测的对象已不限于细胞。更广义的术语是“颗粒”，流经流式细胞仪的被检测的任何对象可通称为“颗粒”。

由流式细胞仪解释为一个颗粒的任何现象，称之为一个“事件”（event）。比如，当流式细胞仪速度不够快时，比较靠近的两个颗粒，可能被检测为一个“事件”。因为大多数通过流式细胞仪的颗粒是单个颗粒并被解释为“事件”，所以，细胞和“事件”有时候互换使用。

流式细胞术是对单一颗粒检测分析的技术，因此，所准备的样本应是颗粒悬液。从流式细胞仪检测的历史来讲，这些颗粒通常是血细胞，它作为理想的检测目标上样前不需要额外的处理。当然培养细胞和细胞系也是流式检测的合适样本，但贴壁的细胞需要稍许处理使其成为悬浮的单细胞悬液后方能进行检测；非单一细胞的样本（如组织）经过处理（机械分离、酶消化）使其成单细胞悬液以适合流式细胞仪分析。

流式细胞术也用于检测不属于细胞的一些颗粒，比如，病毒、细胞核、染色体、DNA片段、乳胶颗粒。随着现代抗原抗体技术以及微球制备工艺的进步，流式也可对通过结合有抗体的微球捕获可溶性蛋白或细胞因子然后进行分析，这些都极大地拓展了流式的使用范围，使其不再仅仅局限于“细胞”的范畴之中。

4.流式细胞仪检测颗粒大小

流式细胞仪检测时，颗粒在极细的液流中流经极窄的激光光斑，因此，颗粒的大小有限制。一般来说，分析型流式细胞仪检测的颗粒在0. 5～50μm。有些特殊流式细胞仪配置小颗粒检测装置，提高检测灵敏度，可检测到小至0. 1μm的颗粒。但分选型流式细胞仪，如MoFlo XDP可对光斑大小进行调节，通过选择不同大小的喷嘴，也能对花粉等大颗粒进行检测。

5.流式细胞仪颗粒检测浓度

流式细胞仪检测的颗粒悬浮于缓冲液中，浓度为5× 10⁵～5×10⁶/ml。这种浓度下，颗粒/细胞基本可单一流经检测区，每一个细胞发出的光信号被检测、收集并存储于数据文件，以待后续分析。

6.颗粒发出的光信号

当颗粒在检测点被激光激发时，检测点周围的透镜收集来自于细胞的光学信号。分为两类信号：散射光信号和荧光信号。

有两类典型的透镜：一个在激光光束的正前方，另一个在与激光光束成直角的方向。在正前方透镜的前面有一个挡光条，大概1mm宽，挡住照射在液流上的激光。液流中颗粒折射的激光信号，只有偏离原方向角度足够大，且未被挡光条挡住，才能到达正前方的透镜及透镜后的检测器，这类信号即是前向散射光信号。而另一个与激光光束成直角的方向上的检测器检测到的则是颗粒对激光的散射光，这类信号即是侧向散射光信号。

荧光信号有两类：①自发荧光信号：有些颗粒（主要是浮游生物）有自然的背景荧光；②荧光染料被激发：样本制备时标记了荧光染料，荧光染料吸收一定波长的激发光源的光后进行能级跃迁，然后释放出另外一种波长的光（即荧光，通常波长比激发光长）。

荧光染料可连接在抗体上，这时一个细胞上的荧光反映的是结合了抗体的蛋白/抗原总量；染料也可直接结合在细胞成分上，如核酸染料可直接结合DNA，反映细胞的倍体。有些染料随胞质的钙离子浓度或跨膜电位差发不同的荧光，这种情况下细胞的荧光反映了细胞对刺激的反应；有些荧光染料在细胞分裂时均分到两个子代细胞，细胞的荧光强度反映的是细胞增殖的数目。

第二节　荧光染料的选择与常用的染色技术

一、荧光染料的特性及其应用

一个分子要发荧光，首先要吸收光能，使电子跃迁到较高能级或激发态，当电子释放出部分或全部光能时，就会发出荧光。几乎所有的情况下，失去的激发能是非辐射性的，失去的能量低于吸收的能量，也就是说，发射光的波长比激发光的要长。主要的激发光与发射光谱主峰之间的差异称为stokes shift，典型的stokes shift不超过几十纳米。

荧光本质上是量子机械运动过程。一个分子吸收光的能力可由消光系数来定量，荧光的量子产率和效率分别是吸收一个光子后释放的光子数和百分比，随着消光系数而增高，也取决于荧光发射后能量的丢失和光非辐射机制。流式细胞仪上应用的部分染料的光量子得率非常高（＞0. 5），但一些有机染料分子的光量子得率易受化学环境的影响。

本来受激可发出荧光的分子因为某些原因，比如与溶剂分子撞击而通过非辐射失去光能，这一现象称为淬灭；这些分子一旦回到电子基态，可重新受激发出荧光。但光的吸收可能伴随着分子结构的改变，不能再进入被激发和发光的周期循环，这称为光漂白。一般来说，荧光分子只有有限的激发、发射周期，随后，被光漂白。

如果荧光素A和B很靠近，A的发射波谱与B的激发波谱重叠，A和B之间就会发生非辐射的光能量转移，激发A（供体）的光波，发出B（受体）的发射波长。能量转移的可能性随光谱重叠的程度而提高，随着荧光素间距离的增大而降低。分子内能量转移决定了复合染料如藻胆蛋白及其结合物的发射光谱。

1.低分子量标记物

UV激发的染料：AMCA，激发波长350nm，发射波长455nm；Alexa350，与AMCA类似，但光量子得率更高。

Cascade Blue：激发波长近390nm，发射波长约415nm，这一染料和Cascade Yellow均可被紫色激光激发。

FITC：发射波长在520nm的荧光染料，是目前最常用的荧光标志物，它的激发波长接近于488nm，光量子得率高，但受pH影响较大；Alexa488染料与FITC有同样的发射波谱，但对环境的敏感性低，是更好的染料。

CY系列染料：是花青染料的系列衍生物，包括CY2、CY3、CY5、CY5. 5、CY7等。CY染料标记的抗体易于黏附在单核细胞上，造成非特异结合；但在粒

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